| Search for content and authors |
Wykorzystanie cytometru przepływowego Apogee A50Micro w ocenie ilościowej i jakościowej mikrocząstek biologicznych |
| Ewa Stępień |
|
Uniwersytet Jagielloński, Instytut Fizyki, Zakład Fizyki Medycznej, Łojasiewicza 1, Kraków 30-387, Poland |
| Abstract |
Mikrocząstki - geneza i biologia Krążące mikrocząstki (MP) to są pęcherzyki pochodzenia komórkowego obserwowane we wszystkich płynach ustrojowych, począwszy od krwi, płynu mózgowo-rdzeniowego, moczu, śliny, mleka oraz płynów jam ciała. Definicja mikrocząstek opiera się głównie o kryterium wielkości, wskazując na obiekty wytwarzane z pęcherzyków na powierzchni błony komórkowej (ang. vesiculation) przez ich „złuszczanie” (ang. exfoliation) lub „wypychanie” (ang. shedding, bubbling). Średnicę określa się między 0,1 a 1,5 mm, czyli więcej niż średnica egzosomów (obserwowanych w próbkach pochodzących z hodowli komórkowych), a mniej niż średnica małych płytek – trombocytów (obserwowanych w próbkach osocza).[1]MP są wytwarzane w odpowiedzi na czynniki stresogenne, takie jak niedotlenienie, uraz mechaniczny[2], [3] lub w wyniku reakcji zapalnej.[4] Utrata asymetrii błony komórkowej towarzysząca uwalnianiu MP ma też związek z aktywacją szlaku apoptotycznego w komórce[5], jednak w przypadku komórek śródbłonka niemal zawsze jest ona wyrazem dysfunkcji[6] lub szeroko pojętej aktywacji.[7],[8] Są liczne doniesienia wskazujące na udział MP w procesach regeneracyjnych, np. w rewaskularyzacji.[9], [10] MP działają jak „transmitery” przenoszące aktywne biologicznie endogenne związki substancje[11], które biorą udział w procesie adhezji i chemotaksji[12] oraz angiogenezy.[13] W chorobach układu sercowo-naczyniowego, takie jak choroba niedokrwienna serca, zawał, udar, kardiomiopatia, nadciśnienie, a także cukrzyca i choroba zakrzepowa mikrocząstki są uważane za markery toczących się procesów patofizjologicznych lub pobudzenia. [14],[15],[16],[17] Mimo wielu dowodów na udział MP w procesach fizjologicznych oraz w odpowiedzi patofizjologiczne bodźce, rola ich nie jest dobrze poznana, a mechanizmy regulujące tworzenie MP są intensywnie badane na modelach in vivo i in vitro. Metody badawcze stosowane do oceny funkcji biologicznej i charakterystyki mikrocząstek Duży postęp, jaki się dokonał w o ostatnich latach, szczególnie w technikach opartych o metody mikroskopowe i cytometryczne, pozwolił również na wprowadzenie nowych narzędzi do badań nad rolą MP oraz oceną ich budowy i funkcji. Szczególne rozwój techniki cytometrii przepływowej, w kierunku zwiększenia rozdzielczości tej metody umożliwia charakterystykę tak małych obiektów jak cząstki o średnicy poniżej 100 nm. Dostępne na rynku cytometry przepływowe o wysokiej rozdzielczości, jakim jest Apogee A50-Micro (Apogee Flow Systems Ltd) mogą różnicować obiekty o średnicy nawet 20 nm, czyli można przy użyciu tego urządzenia analizować nie tylko MP, ale również egzosomy. Przy czym obiekty te można analizować zarówno ilościowo (liczba MP) jak i jakościowo (ocena średnicy obiektu oraz specyficznych antygenów powierzchniowych). Urządzenia te są one dostosowane do metod rutynowo wykorzystywanych w cytometrii przepływowej, t.j. oznaczanie antygenów powierzchniowych za pomocą przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie. Zastosowanie w aparacie Apogee A50-Micro 3 laserów wzbudzenia, pozwala wykonanie jednoczasowo analizy 9-kolorowej , czyli umożliwia szczegółową charakterystykę ilościową i jakościową antygenów znakowanych takimi barwnikami jak: 1/ laser niebieski 488 nm (odczyt: FITC, PE, ECD, PC5, PC5.5, PC7, Alexa Fluor 488, FLMA, PI, 7-AAD, GFP, YFP, Ds-RedFP), 2/ laser czerwony 635 nm (odczyt: APC, APC-Cy7, Alexa Fluor 647, Alexa 700, APC Alexa 700, PE Alexa Fluor 700 3/ laser fioletowy 405 nm (odczyt: DAPI, Hoechst, PacificBlue, PacificOrange, KromeOrange) Można zatem dokładnie określić pochodzenie MP, czy są produkowane przez płytki krwi, czy komórki śródbłonka, oraz ich stan wzbudzenia (apoptoza, dysfunkcja, itp.). Z punktu widzenia zastosowania Apogee A50-Micro do badań nad MP, wysoka rozdzielczość tego urządzenia oraz szerokie spektrum analizy, ma to istotne znaczenia przy poszukiwaniu nowych biomarkerów, charakterystycznych dla dysfunkcji śródbłonka i płytek.[18],[19][1] Stępień E. Postepy Biochemii. 2013;59:395-404 [2] Nieuwland R. Circulation. 1997;96:3534–3541. [3] Miyazaki Y. Blood. 1996;88:3456 –3464. [4] Combes V. J Clin Invest. 1999;104:93-102. [5] Daleke DL J Lipid Res. 2003;44:233–242. [6] Amabile N. J Am Soc Nephrol. 2005;16:3381–3388. [7] Jimenez JJ. Thromb Res 109: 175–180, 2003. [8] Sekuła M. Cell Mol Biol Lett. 2011;16:69-78. [9] Mezentsev A. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005;289: H1106–H1114. [10] Kim HK. Br J Haematol 2004;124: 376–384. [11] Morel O. Curr Opin Hematol 2004;11:156-164. [12] Baj-Krzyworzeka M. Exp Hematol 2002;30: 450–459. [13] Martinez MC. Circ Res. 2011;109:110-119. [14] Bal L. Int J Cardiol. 2010; 145: 321-322. [15] Chirinos J. J Am Coll Cardiol. 2005; 45: 1467-1471. [16] Morel O. Thromb Haemost. 2004; 91: 345-353. [17] Kümpers P. Clin Exp Rheumatol. 2008;26:S86-9. [18] ShantsilaE. Thromb Haemost 2014; 111: 1009–1014 [19] Martinez-Garcia S Br J of Haem. 2014; 166: 571–580 |
| Auxiliary resources (full texts, presentations, posters, etc.) |
|
| Legal notice |
|
| Related papers |
Presentation: Oral at Nano PL 2014, Symposium B, by Ewa StępieńSee On-line Journal of Nano PL 2014 Submitted: 2014-09-30 16:32 Revised: 2014-10-11 15:30 |