Wstęp:

Polskie Towarzystwo Diabetologiczne definiuje cukrzycę jako grupę chorób metabolicznych charakteryzującą się hiperglikemią wynikającą z defektu wydzielania i/lub działania insuliny. Przewlekła hiperglikemia wiąże się z uszkodzeniem, zaburzeniem czynności i niewydolnością różnych narządów, zwłaszcza oczu, nerek, nerwów, serca i naczyń krwionośnych.

Cukrzyca to pierwsza niezakaźna choroba uznana przez ONZ za epidemię XXI wieku. Szacuje się, że w 2035 roku liczba chorych sięgnie 592 milionów.

W Polsce na cukrzycę typu pierwszego i drugiego (cukrzyca typ 1 i typ 2) cierpi około 3 mln osób, przy czym ok. 800 tys. nie wie o swojej chorobie. Jednym z poważniejszych powikłań cukrzycy jest retinopatia cukrzycowa. Jest to schorzenie związane z uszkodzeniem naczyń krwionośnych o średnicy  poniżej100 mm znajdujących się w siatkówce oka. Patomechanizm tego schorzenia opiera się na zmianach w produkcji pozapalnych i proangiogennych cytokin.

Cytokiny są białkami o niskiej masie cząsteczkowej, które biorą udział w przekazywaniu informacji pomiędzy komórkami. Odgrywają one istotną role w odpowiedzi zapalnej, apoptozie, wzroście komórek i ich różnicowaniu. Ich nośnikami mogą być mikrocząstki, które mają postać pęcherzyków o średnicy od 0,1-1 µm. Mikrocząstki powstają z błony komórek mających bezpośredni kontakt z krwią, jak na przykład komórki śródbłonka i płytki krwi. W oznaczeniu cytokin wykorzystano mikromacierze do oznaczania białek. Wykonane one są z opłaszczonych przeciwciałami membran, które pozwalają na bardzo szeroką ocenę zależności międzykomórkowych. Służą one do przesiewowego oznaczenia wielu cytokin (n=43) i porównania poziomu ich ekspresji w próbce o objętości 100 mL. W klasycznej metodzie ELISA przy użyciu takiej samej ilości materiału można uzyskać informacje o stężeniu tylko jednego parametru. Wybrana metoda pozwala przy bardzo niewielkiej ilości materiału  biologicznego określić kluczowe czynniki i mechanizmy chorobowe oraz biomarkerkery, związane z sygnalizacją cytokin.

 Cel badania:

Prowadzone badanie ma na celu ustalenie, które z prozapalnych i proangiogennych cytokin przenoszone są przez mikrocząstki. Istotne jest również określenie jakie zmiany zachodzą w ich profilu u osób chorujących na cukrzyce powikłaną retinopatią. Informacje te mają kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia i zrozumienia patomechanizmu retinopatii cukrzycowej.

Metody:

Nasze badanie objęło 12 pacjentów w tym 5 kobiet i 7 mężczyzn. Za kryterium podziału wybrano poziom hemoglobiny glikowanej (HbA1C).  Zgodnie z wytycznymi Polskiego Towarzystwa Diabetologicznego na 2013 rok wartość HbA1C na poziomie 7% jest wartością graniczną.  Osoby u których poziom hemoglobiny glikowanej przekracza 7% traktowane są jako pacjenci z nieuregulowaną cukrzycą (UCD). Pozostali pacjenci wchodzą w skład grupy z cukrzycą wyrównaną (CD). Trzecią wyodrębniona  grupą są osoby nie chorujące na cukrzycę (C). Do każdej z grup zaklasyfikowano po cztery osoby.

Badanym materiałem było osocze otrzymane z krwi pacjentów pobranej na antykoagulant cytrynianowy (0,109 M). W celu oddzielania osocza od elementów morfotycznych krew pełna była wirowana dwukrotnie przez 15 min przy prędkości kątowej rotora 2500 G. Otrzymane osocze, w którym znajdują się substancje białkowe m.in. cytokiny w stanie wolnym jak i związane z mikrocząsteczkami, porcjowano po 300 µl. Chcąc wyodrębnić mikrocząstki powtórnie zwirować rozporcjowane próbki przez 90 min przy prędkości 16 000 G. Mikrocząstki po wirowaniu zagęszczają się w dolnej frakcji próbki.

Oznaczenie  prozapalnych i proangiogennych cytokin wykonano zarówno w osoczu z mikrocząsteczkami jak i w osoczu ich pozbawionym. Badanie przeprowadzono wykorzystując zestaw mikromacierzy do oznaczania białek firmy Rybiotech serii C. Zestaw ten ma postać mikromacierzy nitrocelulozowych o wymiarach 2x3 cm i umożliwia jednoczesne oznaczenie 43 różnych białek min. czynników wzrostu, proteaz i rozpuszczalnych receptorów. Test ten jest zmodyfikowaną metodą Western blot. Na błonie z nitrocelulozy umieszczone są przeciwciała wychwytujące skierowane przeciwko różnym cytokinom. Oznaczenie opiera się o zasadę wiązania przeciwciała z antygenem. Metoda ta charakteryzuje się wysoką czułości (1pg/ml dla niektórych białek) oraz niską nieprecyzją rzędu 5%. Test ten jest również bardzo swoisty dzięki zastosowaniu wyselekcjonowanych przeciwciał. Detekcja odbywa się na zasadzie pomiaru chemiluminescencji substratu rozkładanego przez związany z przeciwciałem enzym peroksydazę chrzanową. Do detekcji wykorzystano zapis cyfrowy obrazu, uzyskany przy użyciu systemu EC3 Bioimaging firmy UVP z oprogramowaniem Vision Works LS. Do opracowania wyników wykorzystano program ImageJ. 

Wyniki:

Oznaczenia cytokin wykonywano równolegle dla próbek z mikrocząsteczkami oraz dla osocza pozbawionego mikrocząstek. W materiałach poddanych analizie wykryto zwiększoną obecność angiostatyny i RANTES (chemokina β) na mikrocząstkach (Rys. A i B) w stosunku do osocza pozbawionego mikrocząstek (Rys. C i D). Różnica była istotna statystyczni i wynosiła odpowiednio (p=0,03 i p=0,007).

Przeanalizowano różnice pomiędzy próbkami pochodzącymi od chorych na cukrzycę, a próbkami pobranymi od osób zdrowych. Zaobserwowano, że w materiale zawierającym mikrocząstki u chorych z cukrzycą (UCD, CD), znajdują się zwiększone ilości rozpuszczalnego receptora dla naczyniowego śródbłonkowego czynnika wzrostu typ 3 (VEGFR3) (p=0,004) w przeciwieństwie do grupy kontrolnej. Natomiast analiza osocza pozbawionego mikrocząstek pokazała, że w próbkach pochodzących od chorych na cukrzycę obecne są zwiększone stężenia zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów ( bFGF) (p=0,03) oraz śródbłonkowego czynnika wzrostu typ 2 (VEGF2) (p=0,01).

W grupie UCD dodatkowo zauważono jeszcze na mikrocząstkach zwiększone stężenia innych cytokin, takich jak:  TNFα (czynnik martwicy guza α) GRO (onkogenny czynnik stymulujący wzrost α) oraz inhibitorów metaloproteinaz 1 i 2 (TIMP1, TIMP 2) (p<0.05).

Wnioski:

Wykazano, że mikromacierze celulozowe są przydatne do przesiewowych półilościowych oznaczeń czynników proangiogennych (w tym cytokin) w osoczu chorych na cukrzycę. Mimo, że stężenia oznaczanych czynników mieszczą się w zakresach nano i piko molowych, ich czułość pozwala na wykrycie różnic między ilością tych czynników na mikrocząstkach i w osoczu pozbawionym mikrocząstek.

• Legal notice:
  

  Copyright (c) Pielaszek Research, all rights reserved.
  The above materials, including auxiliary resources, are subject to Publisher's copyright and the Author(s) intellectual rights. Without limiting Author(s) rights under respective Copyright Transfer Agreement, no part of the above documents may be reproduced without the express written permission of Pielaszek Research, the Publisher. Express permission from the Author(s) is required to use the above materials for academic purposes, such as lectures or scientific presentations.
  In every case, proper references including Author(s) name(s) and URL of this webpage: https://science24.com/paper/31232 must be provided.