Nowe zastosowanie fotocytometrii przepływowej (ImageStream X Mk II) do analizy mikrocząstek w materiale klinicznym.

Gruszczyński Krzysztof ¹, Kowalik Artur¹, Stępień Ewa²

1.Świętokrzyskie Centrum Onkologii, Zakład Diagnostyki Molekularnej, Artwińskiego 3, 25-734 Kielce , Poland

2.Uniwersytet Jagielloński, Instytut Fizyki, Zakład Fizyki Medycznej  Łojasiewicza 1, Kraków 30-387, Poland

Wstęp
Mikrocząstki (MP) są fragmentami błon większości komórek eukariotycznych. Dzięki mikroskopii elektronowej ich średnicę określono pomiędzy 50 nm, a 1000 nm. Są wytwarzane w komórkach na drodze  egzocytarnego pączkowania lub złuszczania fragmentów błony komórkowej, dzięki czemu składają się komponentów cytoplazmatycznych oraz fosfolipidów i białek błonowych [1]. Pochodzą głównie z megakariocytów, płytek krwi, erytrocytów, monocytów, neutrofili oraz  mogą być wytwarzane przez komórki nowotworowe. Na swojej powierzchni MP posiadają powierzchniowe antygeny odzwierciedlające ich pochodzenie komórkowe [4], co umożliwia wykrywanie poszczególnych subpopulacji MP.

Zasady obrazowania przy użyciu cytometru przepływowego – ImageStream X MkII
Fotocytometr przepływowy Amnis ImageStream X Mk II (ISX) łączy podstawowe możliwości fenotypowania klasycznych cytometrów z zaletami szczegółowego obrazowania cyfrowego mikroskopu fluorescencyjnego, poprzez precyzyjną metodę elektronicznego śledzenia poruszających się obiektów z wieloparametrowym systemem obrazowania o wysokiej rozdzielczości. W ISX zastosowano unikalną technikę (Time Delay Integration), która opiera się na wykorzystaniu matrycy CCD z filtrem rozpraszającym wiązkę światła. Dzięki połączeniu metody naprowadzania fal świetlnych o odpowiedniej długości do określonych obszarów chipa CCD oraz nowatorskiemu systemowi detekcji można zebrać 1000 razy więcej danych o źródle światła jakim są obiekty poddane analizie cytometrycznej, niż w konwencjonalnych technikach. Umożliwia to zapis obrazów przy bardzo niskim poziomie światła [2].

Cel pracy

Celem pracy było wykorzystanie metody fotocytometrii przepływowej do obrazowania obiektów biologicznych (MP) o rozmiarach na pograniczu rozdzielczości optycznej tradycyjnych urządzeń pomiarowych. W tym celu przeprowadzono kalibracje urządzenia na 2 niezależnych systemach opartych o zestawy polistyrenowych monodyspersyjnych kulek kalibracyjnych.

Metody

Urządzenie. Analizę wykonywano przy użyciu metody cytometrii obrazowej drugiej generacji (ImageStream X Mk II, Amnis Corporation, Seattle, WA). Fotocytometr został wyposażony w dwie kamery CCD TDI o wysokiej rozdzielczości każda. Pozwala to na równoczesna pracę z maksymalnie 9 sondami fluorescencyjnymi oraz pozyskanie do 12 obrazów danego obiektu: obraz odzwierciedlający ziarnistości tzw. SideScatter/ Darkfield Channel, dwa obrazy światła przechodzącego (Brightfield Channel), oraz do dziewięciu obrazów fluorescencji. Dostępne powiększenia 20x, 40x lub 60x pozwalają uchwycić szczegóły pojedynczych obiektów o wysokiej rozdzielczości (1200 pcs) dla setek tysięcy z nich [8]. Program wylicza zarówno intensywność jaki i położenie sond fluorescencyjnych oraz umożliwia analizę bardzo różnorodnych próbek i rzadkich subpopulacji bez konieczności wzbogacania próbki przed analizą. Udoskonalona technika przepływu umożliwia przechwytywanie ponad 95% wszystkich obiektów, a prędkość zapisu może przewyższać 1000 obiektów na sekundę.
System ISX łączy obrazy światła przechodzącego z mocą czterech laserów: niebieski laser 488 nm o mocy 200 mW, czerwony 642 nm o mocy 150 mW, fioletowy 405 nm o mocy 120 mW, oraz 70 mW laser 785 nm (Side Scatter - SSC). Wszystkie lasery, które były używane podczas kalibracji i eksperymentów na materiale biologicznym działały z maksymalną mocą.  Obraz obiektu dzielony jest na sześć kolorów składowych poprzez unikalny element rozkładu widma (matryca CCD). ISX jest wyposażony w kilka powiększeń (20, 40, i 60x). W badaniach używano powiększenia 60x o aperturze numerycznej 0,9 z rozdzielczością obrazu około 0,3 x 0,3 μm/pixel. Ponieważ model ten posiada dwie matryce CCD (każda z sześcioma kanałami detekcji sygnału) niezbędne są dwa kanały światła przechodzącego (BrightField - BF). Umożliwia to koordynację przestrzenną między matrycami. Intensywność tła dla BF została ustawiona na 800 dla obydwu matryc.

Oprogramowanie. System ISX wykorzystuje oprogramowanie analityczne IDEAS^TM (Amnis Corporation, Seattle, WA), które oblicza ponad 40 cech ilościowych dla obrazu, czyli do 480 funkcji na komórkę. Cechy te mogą być wykorzystywane przez badacza do wygenerowania histogramów i wykresów korelacji, podobnie jak w klasycznej analizie danych. Zróżnicowane funkcje pozwalają identyfikować populacje na podstawie obrazów opierając się nie tylko na intensywności fluorescencji czy wielkości komórek, lecz również na kształcie i teksturze [2]. Zidentyfikowane grupy mogą być charakteryzowane z wykorzystaniem statystyk populacji np.: średnich, mediany, odchylenia standardowego oraz standardowych testów statystycznych. Prawidłowe badanie ilości MP wymaga jak największego wykluczenia zakłóceń tła. Zaletą ISX jest wykorzystana w oprogramowaniu funkcja pomijania SpeedBead®  podczas akwizycji (mikrosfery, służące do autokalibracji urządzenia w czasie pracy) [8]. Oprogramowanie IDEAS^TM pozwala za pomocą narzędzia Merge .cif files, złożyć w jedną bazę zapis osobnych plików bramkowanych pomiarów, co wykorzystano przy kalibracji zestawami Sphero^TM.

Kalibratory. Analiza danych w klasycznych cytometrach przepływowych opiera się na dwóch parametrach Forward Scatter (FSC) oraz/lub SSC. W ImageStream X Mk II kanał FSC zastąpiono kanałem światła przechodzącego tzw. Brightfield Channel. Ma to bezpośredni związek z wyborem rodzaju kalibratora. Do kalibracji urządzenia wykorzystano 2 zestawy kulek kalibracyjnych wykorzystywanych do kalibracji ustawień cytometrów przepływowych w analizie MP:

1.Zestaw Megamix–Plus SSC (cat no. 01077 – Biocytex, Marseille, France) dedykowany do urządzeń opierających analizy na  SSC  jako głównym parametrze analizy. Megamix–Plus SSC to mieszanina fluorescencyjnych kulek o średnicach: 160, 200, 240, oraz 500 nm, tak dobranych, aby pokrywać się z przewidywanymi rozmiarami MP (0,1 do 1 μm), wykorzystując SSC jako pochodną wielkości. Dodatkowo obiekty związane są z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) – fluorochromem o długości fali emisji w przedziale 480 – 560 nm. W przypadku ISX MkII generowany jest zielony obraz fluorescencji odczytywany na kanale drugim (Ch02).

2.Zestaw kalibracyjny -  Sphero^TM Flow Cytometry Nano Fluorescent Size Standard Kit 0.1-0.3 μm, 0.4-0.6 μm, 0.7-0.9 μm & 1.0-1.9 μm (cat no. NFPPS-52-4K, Spherotech Inc, Lake Forest, IL): cztery oddzielne grupy kulek o średnicach: 220, 450 i 880 nm oraz 1,33 μm. Do określenia parametrów optycznych najmniejszych obiektów zastosowano kalibrator Nano Fluorescent Size Standard kit 0.05-0.15 μm (cat no. NFPPS-0152-5, Spherotech Inc, Lake Forest, IL) o średnicy 130 nm.

Algorytm akwizycji obrazu i analizy danych.

1. Dla zestawu Megamix–Plus SSC zapis prowadzono z obszaru obejmującego pojedyncze obiekty (Single). Bramkę utworzono na wykresie punktowym Area_BF do Aspect_Ratio_BF (Rys. 1a). Zapisano plik zawierający 60 000 obiektów. Grupa ta posłużyła za populację wyjściową do analizy w programie IDEAS^TM. W oparciu o populację Single wygenerowano wykres punktowy intensywności FITC do intensywności SSC (Rys.1b). Wykorzystując odczyt zagęszczenia obiektów (Rys. 1c) oznaczono wszystkie poszukiwane populacje na tle pozostałych obiektów z bramki Single (Rys 1d).

Rys 1. Algorytm akwizycji danych dla zestawu kalibracyjnego Megamix–Plus SSC do analizy mikrocząstek za pomocą fotocytometru przepływowego Amnis ImageStream X Mk II.

2.Dla zestawu Sphero^TM zapis kalibracji wykonano na identycznych ustawieniach urządzenia jak w przypadku pierwszego zestawu, a analizę przeprowadzono według tych samych procedur dla każdej populacji kulek osobno. Do analizy zebrano dane dla 5000 obiektów. Za pomocą narzędzia Merge .cif files złożono w jedną bazę zapis osobnych plików bramkowanych pomiarów, co przedstawiono na wykresie punktowym (Rys. 2 a,b) i histogramach pomocniczych (Rys 2 c,d).:

Rys 2. Algorytm akwizycji danych dla zestawów kalibracyjnych SpheroTM Flow Cytometry Nano Fluorescent Size Standard do analizy mikrocząstek za pomocą fotocytometru przepływowego Amnis ImageStream X Mk II.

Wyniki                  

Standardowa procedura analizy w programie IDEAS^TM  pozwala odrzucić obiekty nieostre oraz aglomeraty przeprowadzając użytkownika przez kilka prostych histogramów i wykresów punktowych. Stąd różnice między liczbą zapisanych obiektów, a rzeczywistą ilością analizowanych obiektów.

Na postawie danych ilościowych uzyskanych w wyniku akwizycji w oparciu o opisane algorytmy uzyskano procentowy rozdział wszystkich populacji kulek kalibratora Megamix–Plus SSC. Wyniki w porównaniu z wartościami referencyjnymi dostarczonymi przez producenta zaprezentowano w Tabeli 1.

Tabela 1. Porównanie liczby obiektów oraz ich udziału procentowego dla kalibratora Megamix–Plus SSC oraz cytometru ISX MkII.

Instrukcja do zestawu Sphero^TM zawiera porównanie wyników dla różnych cytometrów przepływowych [10]. Rozdział populacji jaki otrzymaliśmy na ISX jest zbliżony do danych przedstawionych w instrukcji (Tabela 2).

Tabela 2. Porównanie liczby obiektów oraz ich udziału procentowego dla kalibratora Sphero^TM oraz cytometru ISX MkII.

 Wnioski.
Stale przyśpieszający rozwój technologii oferuje coraz nowsze narzędzia diagnostyczne. Nowoczesna cytometria przepływowa, a zwłaszcza system ImageStream X Mk II, który łączy w sobie możliwości wysoce dokładnego cytometru przepływowego z mikroskopem fluorescencyjnym umożliwia dokładniejsze zliczanie oraz analizę obiektów tak małych jak np. bakterie czy mikrocząstki. Jest to o wiele bardziej czuła metoda niż standardowa cytometria przepływowa. Poza obrazowaniem fluorescencyjnym umożliwia morfologiczną charakterystykę obiektów. Co ważniejsze, program IDEAS^TM  pozwala na analizę danych, przy pomocy ogólnie znanych z klasycznych cytometrów narzędzi - np. histogramów i wykresów punktowych, co czyni analizę łatwiejszą do przeprowadzenia. System pozwala także obejrzeć dowolny obiekt, po wcześniejszym wybraniu na wykresie odpowiadającego mu punkt pomiarowego.

Zastosowanie dwóch zestawów kalibratorów miało na celu uzyskanie powtarzalnych wyników przy użyciu dwóch rożnych systemów do kalibracji urządzeń, gdzie znane są parametry obiektów. Dodatkowo, analiza populacji kulek o średnicy 130 nm dostarczyła informacji o granicy czułości urządzenia i pozwoliła na powiększenie obszaru akwizycji na korzyść obiektów mniejszych niż 150 nm. Badanie populacji 1,33 μm umożliwiło powiększenie obszaru zaczytywania mikrocząstek o obiekty zbliżone rozmiarami do  górnej granicy wielkości MP.

Otrzymane w wyniku przeprowadzonej kalibracji ustawienia urządzenia ISX posłużą do przeprowadzenia analizy biologicznych MP uzyskanych z próbek klinicznych, takich jak osocze, surowica i inne płyny fizjologiczne.


Literatura
1. Stępień E, Targosz-Korecka M, Mikrocząstki w regulacji funkcji śródbłonka. Postepy Biochemii 2013, 59 (4)
2. Basiji D.A, Ortyn W. E, Liang L, Venkatachalam V, Morrissey P. Cellular Image Analysis and Imaging by Flow Cytometry. National Institutes of Health 2007, 27(3)
3. Erdbruegger U, Rudy C.K, Etter M.E, Dryden K.A, Yeager M, Klibanov A.L, Lanngan J. Imaging Flow Cytometry Elucidates Limitations of Microparticle Analysis by Conventional Flow Cytometry. Cytometry Part A 2014

4. Doormaal van F.F, Kleinjan A, Nisio Di M, Buller H. R, Nieuwland R. Cell - derived microvesicles and cancer. The Netherlands Journal of Medicine. 2009
5. Heyde van der H.C, Gramaglia I, Combes V, George T.C, Grau G,E. Flow Cytometric Analysis of Microparticles. Flow Cytometry Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 699, Springer Science+Business Media, LLC 2011
6. Orozco A.F, Lewis D. E. Flow Cytometric Analysis of Circulating Microparticles in Plasma. Cytometry Part A, 2010
7. Italiano J. E Jr, Mairuhu A.T.A, Flaumenhaft R. Clinical Relevance of Microparticles from Platelets and Megakaryocytes. National Institutes of Health 2010, 17(6)
8. Amnis Corporation. INSPIRE. ImageStreamX System Software User’s Manual, Amnis Corporation, Seattle, WA, 2012
9. Biocytex. Package insert MEGAMIX Plus – SSC, Biocytex 2013
10. Spherotech. Sphero^TM Flow Cytometry Nano Fluorescent Size Standard Kits, Spherotech 2014

• Legal notice:
  

  Copyright (c) Pielaszek Research, all rights reserved.
  The above materials, including auxiliary resources, are subject to Publisher's copyright and the Author(s) intellectual rights. Without limiting Author(s) rights under respective Copyright Transfer Agreement, no part of the above documents may be reproduced without the express written permission of Pielaszek Research, the Publisher. Express permission from the Author(s) is required to use the above materials for academic purposes, such as lectures or scientific presentations.
  In every case, proper references including Author(s) name(s) and URL of this webpage: https://science24.com/paper/31217 must be provided.

1. Solutions and problems in the diagnosis and treatment of cancer